UA-Myco 巢式 PCR 支原体检测试剂盒用于定性检测细胞培养中的支原体污染。95%以上的细胞 培养中的支原体污染是由 Mycoplasma fermentans，M.orale，M.pirum，M.hyorhinis，M. hominis，M.salivariu，M.arginine 和 Acholeplasma laidlawii支原体所导致。该试剂盒通过巢式 PCR 方法扩增细胞培养基中包括以上八种和其他多种常见支原体的保守基因片段，从而判断是否存在支原体污染。该试剂盒具有快速，灵敏度高和特异性高的特点。每个反应能够检测到低至 10 个支原体基因数，特别是对 Acholeplasma laidlawii支原体的检测灵敏度有很大的提高，并 且和细菌或培养细胞无交叉反应。
1. 待测细胞培养基准备
1) 从对数生长期的细胞培养中取1mL细胞培养基。
2) 细胞培养基室温离心200g，5分钟。将大约800μL培养基转到新的离心管中，注意不要带入离下的细胞碎片
3) 用以上准备的细胞培养基作为巢式PCR的模板进行支原体检测。
2. 巢式PCR反应
1) 第一PCR反应：以通用的2XPCR预混液试剂为例：
PCR 反应组装（推荐冰上配制）
组分 | 体积 ( μL） |
2xPCR Mix | 25 |
1st PCR 引物 P1 | 2 |
模板（细胞培养基） | 1 |
PCR 反应内参 | 2 |
加无菌超纯水至 | 50 |
PCR 反应条件: 30 循环，条件见下表
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5min | 1 |
变性 | 94℃ | 30s | 30 |
退火 | 55℃ | 30s | 30 |
延伸 | 72℃ | 40s | 30 |
终延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
2) 从第一PCR反应中取1μL作为第二PCR的模板并用引物P2进行第二PCR。第二PCR反应组装（推荐冰上配制）见下表。PCR反应条件同第一PCR反应。
组分 | 体积 ( μL） |
2xPCR Mix | 25 |
2nd PCR 引物 P2 | 2 |
模板（1st PCR 产物） | 1 |
加无菌超纯水至 | 50 |
3) 准备2%的琼脂糖胶。取10µl的第二PCR产物做DNA电泳。
3.结果
PCR反应内参为515bp单一DNA条带，常见支原体污染会产生236bp-365bp单一DNA条带，Acholeplasmalaidlawii污染会产生426bp和219bp的双DNA条带。
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