RT-qPCR 在基因表达检测及定量中使用极为广泛。传统的 RT-qPCR 虽然有一步法，但是涉及到样本 RNA 提取，过程 繁杂，影响因素较多，检测通量很低。该试剂盒是免提取一步法 RT-qPCR 检测试剂盒，细胞洗涤后，直接加裂解液裂解，裂解液直接用作模版进行 RT-qPCR 扩增，从细胞准备到 PCR 结束可以在不到两小时的时间内完成，程序标准化，大大缩短了检测时间及影响因素，大大增加了检测通量。

本检测试剂盒为染料法（SYBR Green）, 正式检测前 PCR 各参数需要先进行优化验证，以保证检测特异性及灵敏度。 本检测试剂盒不包括 DNA 酶处理，因为 DNA 酶处理存在消化不完全的可能，残留 DNA 模板依然可能影响后期定量， 同时 DNA 酶处理还存在灭活不完全的可能，残留 DNA 酶活性可能影响后期 PCR 扩增的 DNA 定量。因此，引物设计 时需要以 RNA 序列为依据，扩增产品需要至少覆盖 2 个外显子，确保扩增系统不能以 DNA 为模板进行扩增，而只 能以 RNA 为模板进行扩增。

该试剂盒由细胞裂解液 L 试剂，扩增缓冲液 B 试剂，扩增酶 mix E 试剂组成。具体规格如下：

1.细胞准备：待检测孔细胞需要在100至15000个细胞范围内。贴壁细胞吸去培养液后，用室温的DMEM无血清培养液洗涤一次，弃洗涤液后，加细胞裂解液。悬浮细胞离心吸去培养液后，用室温的DMEM无血清培养液洗涤一次，弃洗涤液后，加细胞裂解液。

2.细胞裂解：96孔培养板每孔加50μlL试剂，384孔培养板每孔加10μl L试剂，轻拍培养板数次，室温振摇10至15分钟。细胞裂解产物（lysate）使用完之后需要尽快放回2～8℃保存，低温保存时间不超过8小时。不建议长期保存细胞裂解产物。

3.RT-qPCR准备：按下列次序准备20μl反应体系：10μl B试剂，4μl E试剂，2μl引物mix，2μl细胞裂解产物模板，2μl无酶水。20μl反应体系中细胞裂解产物不建议超过2μl。

4.RT-qPCR扩增：逆转录42～50℃,20～30分钟，然后95℃1分钟。qPCR参数需要根据特定的目标基因及引物序列的预实验结果确定。以下是一个housekeeping基因的扩增设定，供参考：
逆转录：45℃,20分钟；然后95℃1分钟。
PCR扩增：94℃20秒，62℃20秒，70℃20秒（收集荧光信号），35～40个循环；然后72℃3分钟。

5.必要时进行熔解曲线分析。

6.结果分析。

1.引物设计：需要以RNA序列为依据，扩增产物至少覆盖2个外显子，确保扩增系统不能以基因组DNA为模板进行扩增，而只能以RNA为模板进行扩增。在下列情况下可以实现：a.2个外显子之间的内含子比较长，以基因组为模板的扩增长度明显超出系统中的聚合酶在扩增延伸时间内所能完成的扩增长度；b.2个外显子之间的内含子比较短，但至少有一条引物的最3末端的2至5个碱基与其5末端一侧的其余碱基分布在不同的外显子上且与邻近内含子5末端碱基序列不同（参考下图），使得以DNA为模板的扩增成为不可能。必要时请联系产品技术支持协助。

2.PCR扩增参数及体系：任何一个PCR，任何一对扩增引物，都需要经过预实验，确定最佳扩增温度与时间设定，引物量，酶量，甚至Mg2+浓度调整，这对检测特异性与灵敏度非常重要。需要做类似细胞数梯度检测预实验，在获得良好的线性关系之后再开始微孔板大通量实验。

3.熔解曲线：染料法扩增系统中任何特异性的或非特异性的扩增产物包括引物二聚体等都可以给出扩增信号，不同细胞或细胞处理的化学物质也可能对PCR扩增有所影响，熔解曲线分析可以完美地区分特异性的与非特异性扩增及引物二聚体等。熔解曲线分析在预实验实验参数确定过程中就需要使用。