实验细胞：RAW264.7

一、M1极化

培养条件：6孔细胞培养板，每孔2*10^5个细胞（细胞不宜过多，否则影响极化效果），37°C，5% CO₂培养24h。将培养基更换为DMEM+2%FBS(减少血清中细胞因子的影响)，按照下表添加对应的细胞因子，37°C，5% CO₂培养24h。

流式检测流程：

1. 收集细胞：细胞因子干预24h后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹 打重悬，离心收集细胞。

2. 计数：用0.5ml的1%BSA重悬细胞，计算细胞总数，观察细胞活率，活率需达到95%以上。

3. 孵育抗体：加入PE Rat anti-Mouse CD86 mAb (A27137) (抗体用量参考说明书）或者同型对照，室温孵

育30min 。

4. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。

5. 死活染料染色：每孔加入Zombie Violet™ Fixable Viability Kit (423114) (用量参考说明书），室温避光孵育15min。

6. 洗涤细胞：用1%BSA洗涤细胞，去除残留的抗体，用1%BSA重悬细胞。

7. 上机检测。

二、 M2极化

培养条件：6孔细胞培养板，每孔2*10^5个细胞（细胞不宜过多，否则影响极化效果），37°C，5% CO₂培养24h。将培养基更换为DMEM+2%FBS(减少血清中细胞因子的影响)，按照下表添加对应的细胞因子，37°C，5% CO₂培养24h。

流式检测流程：

1. 收集细胞：细胞因子干预24h后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹 打重悬；离心收集细胞。

2. 计数：用0.5ml的1%BSA重悬细胞，计算细胞总数，观察细胞活力，需达到95%以上。

3. 死活染料染色：离心后用PBS重悬细胞至细胞密度为1*10^7/ml，100 μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Zombie Violet™ Fixable Viability Kit (423114) (用量参考说明书），室温避光孵育15min，300Xg 离心5min，弃上清。

4. 固定：细胞用0.2mL 4%多聚甲醛重悬固定，室温避光放置15min，300Xg 离心5min，弃上清（去除残留的固定液）。

5. 破膜：细胞用0.2ml 1X破膜剂（Thermo #00-8333-56）重悬破膜，室温避光放置30min，400Xg 离心5min，弃上清。

6. 洗涤细胞：每孔加入0.2ml 1X破膜剂重悬细胞，400Xg 离心5min，弃上清；

7. 封闭：每孔加入0.1ml 1X破膜剂，并加入2μg CD16/CD32( S0B7003 )抗体进行封闭，冰上放置30min，400Xg 离心

5min，弃上清。

8. 孵育抗体：每孔加入0.1ml 1X破膜剂，并加入APC anti-Mouse CD206 (MMR) mAb (A26785) (抗体用量参考说明书）或者同型对照APC Rat IgG Isotype Ctrl Antibody），室温孵育 30min，400Xg 离心5min，弃上清（去除残留的抗体）。

9. 洗涤细胞：每孔加入0.2ml 1%BSA洗涤细胞，400Xg 离心5min，弃上清，重复洗涤2次，用200μl 1%BSA

重悬细胞。

10. 上机检测。